De stichting van de Orde wordt gesitueerd rond het jaar 1050. Volgens de geschiedschrijvers kregen kooplui van de vroegere republiek Amalfi van de kalief van Egypte de toestemming om in Jeruzalem een kerk, een abdij en een hospitaal te bouwen waar zieke pelgrims, ongeacht hun ras of religie, konden worden verzorgd. De Hospitaalridders van Sint-Jan van Jeruzalem, de monnikengemeenschap die het hospitaal voor de pelgrims in het Heilig Land beheerde, groeide uit tot een onafhankelijke kerkelijke Orde onder leiding van de zalige Gerardus. Op 15 februari 1113 vaardigde Paus Paschalis II een bul uit waarin de stichting van de Broederschap werd bekrachtigd en die de Orde onder bescherming van de Heilige Stoel plaatste. Zo verkreeg zij het recht om zelf haar leider kiezen, zonder enige geestelijke of wereldlijke inmenging.

De taak van de orde bestond erin de zieken en de pelgrims te verzorgen en te verdedigen in de gebieden die de kruisvaarders op de moslims hebben veroverd. Zo kreeg de Orde tegelijk een religieuze, verzorgende en militaire rol. Alle Ridders van de Orde waren dus geestelijken verbonden door de drie geloften van armoede, kuisheid en gehoorzaamheid.

De Orde koos als embleem het witte, achtpuntige kruis dat het ook vandaag nog het symbool is van Sint Jan en breidde zijn missie uit tot de verdediging van het christendom in het algemeen.

1310 : Rhodos

Nadat in het Heilig Land het laatste christelijke bastion was gevallen, vestigde de Orde zich eerst op Cyprus en daarna, in 1310, op het eiland Rhodos, onder leiding van Grootmeester Frà Foulques de Villaret. Voor de verdediging van de christelijke wereld bleek het noodzakelijk om over een zeemacht te beschikken. De Orde bouwde dan ook een machtige vloot, die patrouilleerde in het oostelijke gedeelte van de Middellandse Zee en deel nam aan talloze, vaak beroemde veldslagen voor het christendom, zoals de kruisvaarten naar Syrië en Egypte.

De Paus garandeerde de onafhankelijkheid van de Orde ten opzichte van de andere naties alsook het universeel erkend recht om over een krijgsmacht te beschikken en te ontplooien. Van bij het begin waren dit de grondslagen van de internationale soevereiniteit van de Orde.

In het begin van de veertiende eeuw waren de in Rhodos verblijvende leden van de Orde afkomstig uit alle delen van Europa. De vestigingen van de Orde in Europa werden ingedeeld in zeven (taal)groepen of 'Langues': Provence, Auvergne, Frankrijk, Italië, Aragon (Navarra), Engeland (met Ierland en Schotland) en Duitsland. In 1492 scheurden Kastilië en Portugal zich af van Aragon om een achtste groep te vormen. Elke Langue bestond uit Prioraten en Grootprioraten, Balijen en Commanderijen.

De Orde werd bestuurd door de Grootmeester (de prins van Rhodos) en de Raad, sloeg een eigen munt en onderhield diplomatieke betrekkingen met andere staten. De hoogste functies van de Orde werden toegekend aan vertegenwoordigers van verschillende Langues en ook de zetel van de Orde, het Convent, was samengesteld uit leden van verschillende Langues.

1530 : Malta

Na een zes maanden durend beleg en hevige gevechten tegen de vloot en het leger van sultan Süleyman II de Grote dienden de Ridders zich in 1523 uiteindelijk over te geven. Daarop konden ze Rhodos met militaire eer verlaten. Het duurde tot 1530 vooraleer de Orde opnieuw over een grondgebied beschikte. In dat jaar deed keizer Karel V namelijk met de zegen van Paus Clemens VII afstand van het eiland Malta ten voordele van Grootmeester Frà Philippe de Villiers de l'Isle Adam. Een van de bepalingen van de overeenkomst was dat de Orde neutraal diende te blijven bij conflicten tussen de christelijke staten. In 1565 verdedigden de Ridders, aangevoerd door Grootmeester Frà Jean de la Vallette, die zijn naam zou geven aan La Valette, de hoofdstad van Malta.

1571 : De slag bij Lepanto

De vloot van de Orde, op dat moment één van de machtigste van de Middellandse Zee, droeg bij aan de totale vernietiging van de Ottomaanse zeemacht tijdens de zeeslag van Lepanto in 1571.

1798 : Ballingschap

200 jaar later, in 1798, werd het eiland bezet door Napoleon Bonaparte, die op weg was naar Egypte. Op grond van de regel die hen verbood om strijd te voeren tegen andere christelijke mogendheden, waren de Ridders gedwongen om Malta te verlaten. In 1800 werd Malta ingenomen door de Engelsen, en ondanks de erkenning van de soevereine rechten van de Orde op het eiland in het Verdrag van Amiens (1802), slaagde de Orde er niet meer in om het eiland Malta weer in bezit te krijgen.

1834 : Rome

Na tijdelijk onderdak gevonden te hebben in achtereenvolgens Messina, Catania en Ferrara, vestigde de Orde zich in 1834 in Rome, in het Paleis van Malta (Via Condotti 68) en een villa op de Aventijn, die beide als exterritoriaal werden beschouwd.

De 20ste en 21ste eeuw

Vanaf deze periode werden hulpverlening en liefdadigheid de enige missies van de Orde. Dankzij de bijdrage van de prioraten en de Nationale afdelingen van de Orde overal ter wereld bleef de doeltreffendheid van de acties toenemen gedurende de hele eeuw.
De hulpverlenings- en verzorgingsactiviteiten werden op grote schaal gelanceerd tijdens de twee wereldoorlogen. Ze werden voortgezet onder de leiding van Grootmeester Fra' Angelo de Mojana di Cologna (1962-1988) en worden nog verder uitgebreid door zijn opvolgers, Frà Andrew Bertie (1988-2008), en de huidige Grootmeester Frà Matthew Festing.